植物線粒體提取試劑盒

 一，試劑盒組份

二，說明

植物線粒體提取試劑盒可用于從植物葉片組織中分離出完整而純化的線粒體。適合于田間采摘或者實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的植物葉片中線粒體的制備。其制備物，可以被用于細(xì)胞凋亡、信號傳遞、代謝和蛋白組學(xué)等的研究。但不適用于進(jìn)一步DNA提取。

三，操作步驟

1. 樣本采集前處理：無論田間自然生長還是實(shí)驗(yàn)室組織培養(yǎng)，采摘前須避光生長24-48小時，以減少葉片組織中糖類及葉綠體含量。取適量Lysis Buffer，加入0.5% β-巰基乙醇，10ml Lysis Buffer加入50ulβ-巰基乙醇，混勻，形成Lysis Buffer/β-巰基乙醇溶液，此溶液可2-8度保存一個月。

2. 葉片用蒸餾水清洗2-3次，濾紙吸干，有條件請用液氮研磨葉片1-2克，研磨完后，取800mg左右研磨的葉片粉，加入1.5ml預(yù)冷的Lysis Buffer/β-巰基乙醇溶液，混勻。如果無條件（無液氮），請預(yù)冷研缽，取洗過的葉片1000 mg，用剪刀剪為碎塊放入玻璃勻漿器或者研缽中。加入1.5ml預(yù)冷的Lysis Buffer/β-巰基乙醇溶液，冰上研磨至看不見明顯組織塊；

3. 將研磨物放置合適的離心管，4℃，1000× g 離心5 min；

4. 將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中，在沉淀中加入0.5ml Lysis Buffer/β-巰基乙醇溶液，混勻，再次4℃，1000× g 離心5 min，取上清；合并兩次上清，將上清4℃ 1000× g 再次離心5 min。

5．取上清，加入一新的離心管中，4℃， 16,000 × g 離心10 min。離心后的上清含胞漿成分，可從中提取胞漿蛋白。將上清轉(zhuǎn)移到新離心管，線粒體沉淀在管底。

6. 在線粒體沉淀中加入0.5 mL  Wash Buffer重懸線粒體沉淀，4℃，1000× g 離心5 min；

7．取上清，加入一新的離心管中，4℃， 16,000 × g 離心10 min。棄上清，高純度的線粒體沉淀在管底；

8. 用50 -100μL Store Buffer 或合適的反應(yīng)緩沖液重懸線粒體沉淀，立即使用或-70℃保存。

四 注意事項(xiàng)：
1. 以離心力g計(jì)算正確的離心速度，不同的離心機(jī)可據(jù)此精確計(jì)算離心速度。
2. 進(jìn)行Western Blot和2D-膠電泳，可直接在第7步的沉淀中加入上樣緩沖液裂解線粒體。

3. β-巰基乙醇有毒，請注意通風(fēng)及防護(hù)

五 儲存：本試劑盒三個月內(nèi)使用可4℃儲存，長期可置-20℃。

一般低溫度心機(jī)都有離心力顯示，如果沒有，可以用以下公式簡單的換算。

G＝1.11×(10^-5)×R×[rpm]^２
G為離心力，一般以ｇ（重力加速度）的倍數(shù)來表示；

 [rpm] ２即：轉(zhuǎn)速的平方； R為半徑，單位為厘米。